Fibromialgia

La disfunción mitocondrial y la activación mitophagy en las células mononucleares de la sangre de los pacientes con fibromialgia: implicaciones en la patogénesis de la enfermedad

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2875645/?tool=pmcentrez
 
Artritis Res. Ther. 2010; 12 (1) : R17.
Publicado en Internet el 28 de enero 2010 doi:  10.1186/ar2918
PMCID: PMC2875645

 

Mario Cordero D , 1, 2, Manuel De Miguel , Ana M Moreno Fernández , M Inés Carmona López , Juan Garrido Maraver , 1, David Cotán , 1, Lourdes Gómez Izquierdo , Pablo Bonal , Francisco Campa , 5, Pedro Bullón , 7Plácido Navas , 1, 2 y José A. Sánchez Alcázar autor correspondiente1, 2
 
 

Resumen

Introducción

La fibromialgia es un síndrome de dolor crónico de etiología desconocida. Estudios recientes han mostrado cierta evidencia que demuestra que el estrés oxidativo puede tener un papel en la fisiopatología de la fibromialgia. Sin embargo, todavía no está claro si el estrés oxidativo es la causa o el efecto de las anomalías documentadas en la fibromialgia. Por otra parte, el papel de las mitocondrias en el desequilibrio redox informó en la fibromialgia también es controvertido. Se realizó este estudio para investigar el papel de la disfunción mitocondrial, el estrés oxidativo, y mitophagy en la fibromialgia.

Métodos

Se estudiaron 20 pacientes (2 varones, 18 pacientes de sexo femenino) de la base de datos de la Asociación de Fibromialgia de Sevilla y 10 controles sanos. Se evaluó la función mitocondrial en las células mononucleares de sangre de pacientes con fibromialgia de medición, la coenzima Q 10 niveles con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), y el potencial de membrana mitocondrial con la citometría de flujo. El estrés oxidativo se determinó midiendo la producción de superóxido mitocondrial con MitoSOX ™ y la peroxidación de lípidos en las células mononucleares de la sangre y del plasma de los pacientes con fibromialgia. Activación autofagia se evaluó mediante la cuantificación de la intensidad de fluorescencia de LysoTracker ™ tinción Rojo de las células mononucleares de sangre. Mitophagy fue confirmada por la medición de actividad de la citrato sintasa y el examen de microscopía electrónica de las células mononucleares de sangre.

Resultados

Hemos encontrado niveles reducidos de la coenzima Q 10 , la disminución de potencial de membrana mitocondrial, el aumento de los niveles de superóxido mitocondrial en las células mononucleares de la sangre, y el aumento de los niveles de peroxidación de los lípidos en las células mononucleares de sangre ambos y del plasma de los pacientes con fibromialgia. La disfunción mitocondrial también se asoció con incremento en la expresión de los genes autofágicas y la eliminación de las mitocondrias disfuncionales con mitophagy.

Conclusiones

Estos hallazgos pueden apoyar el papel del estrés oxidativo y mitophagy en la fisiopatología de la fibromialgia.

 

Introducción

La fibromialgia (FM) es un síndrome de dolor crónico común acompañado de otros síntomas tales como fatiga, dolor de cabeza, trastornos del sueño y depresión. Se diagnostica de acuerdo a los criterios de clasificación establecidos por el American College of Rheumatology (ACR) [ 1 ]. A pesar de ser un trastorno común que afecta al menos a 5 millones de personas en los Estados Unidos [ 2 ], su mecanismo patogénico sigue siendo difícil de alcanzar. Los marcadores de estrés oxidativo Recientemente se han propuesto como un hecho relevante en la patogenia de esta enfermedad [ 3 , 4 ].

Anteriormente, se detectó disminución de la coenzima Q 10 (CoQ 10 ) y el aumento de los niveles de especies reactivas del oxígeno (ROS) en las células mononucleares de la sangre de los pacientes con FM, proporcionando evidencia directa de aumento del estrés oxidativo a nivel celular [ 5 ]. La CoQ 10desempeña un papel crucial en el metabolismo celular, que actúa como un transportador de electrones entre los complejos I y II y el complejo III de la cadena respiratoria mitocondrial. La CoQ 10 también se ha informado a desempeñar un papel importante en la regulación de proteínas de desacoplamiento, la transición de permeabilidad mitocondrial de los poros, de oxidación-β de ácidos grasos, y la vía de la biosíntesis de nucleótidos [ 6 ]. Además, CoQ 10 niveles se han sugerido para ser útil como un marcador mitocondrial-disfunción [ 7 ]. La CoQ 10 carencia induce la disminución de las actividades del complejo II + III, III, IV, complejo y compleja, la reducción de expresión de las proteínas mitocondriales implicadas en la fosforilación oxidativa, la disminución de potencial de membrana mitocondrial, aumento de la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), la activación de la transición de permeabilidad mitocondrial (MPT ), mitophagy disfuncionales de las tasas de crecimiento las mitocondrias, y la reducción de [ 8 , 9 ].

El propósito del presente trabajo fue evaluar la disfunción mitocondrial en las células mononucleares de la sangre de los pacientes con FM y para dilucidar si la perturbación mitocondrial estuvo involucrado en la fisiopatología del estrés oxidativo presente en FM.

 

Materiales y métodos

Los pacientes y controles

El estudio se realizó con el consentimiento informado de todos los participantes y la aprobación del comité de ética local. Se estudiaron 20 pacientes (dos hombres y 18 pacientes de sexo femenino) reclutados en la base de datos de la Asociación de Fibromialgia de Sevilla (AFIBROSE) y 10 controles sanos (dos hombres y ocho pacientes de sexo femenino). El diagnóstico de la FM fue establecido por un reumatólogo experimentado de acuerdo con los criterios del ACR [ 1 ]. Todos los pacientes y controles no había tomado ninguna droga o vitamina / suplemento nutricional durante un período de 15 días antes de la recolección de las muestras de sangre.

Los cultivos de sangre las células mononucleares

Las células mononucleares de sangre periférica (PMP) fueron purificados a partir de sangre heparinizada con centrifugación isopícnica mediante Histopaque-1119 y 1077 Histopaque-(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.). BMC se cultivaron a 37 ° C en un 5% de CO 2 atmósfera en medio RPMI-1640 suplementado con L -glutamina, una solución de antibiótico / antimicótico (Sigma Chemical Co.), y 10% de suero fetal bovino.

Medición de la CoQ 10 niveles

CoQ 10 contenidos en BMC se analizaron con HPLC (Beckman Coulter, Brea, CA, EE.UU.; 166-126 HPLC) con detección ultravioleta (275 nm), de acuerdo con el método de Montero y colegas

Potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm)

BMC fueron cultivadas en seis placas (35 mm de diámetro así) hasta su confluencia. Mitotracker CMXRos Roja (Invitrogen / Molecular Probes, Eugene, OR, USA) 100 nmol / L y se incubó durante 30 minutos. Entonces las células se lavaron y se analizaron con citometría de flujo.

ROS mitocondrial de producción

La generación de ROS mitocondrial en la BMC se evaluó con MitoSOX ™ (Invitrogen / Molecular Probes, Eugene, OR, USA) se incubaron con 1 mmol / L MitoSox durante 30 min a 37 ° C y se lava dos veces con PBS. Las células se analizaron con citometría de flujo. Para ensayar la producción de ROS con los antioxidantes, las células mononucleares se incubaron 24 h con 10 mmol / L de CoQ 10 , 30 mol / L α-tocoferol (α-toc), y 10 mmol / l N -acetilcisteína (N-Acet, Sigma Chemical Co .).

La peroxidación lipídica

TBARS (sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico) los niveles en plasma se determinaron por un método basado en la reacción con ácido tiobarbitúrico a 90-100 ° C. La peroxidación de lípidos en las células se determinó mediante el análisis de la acumulación de lipoperóxidos con un kit comercial de Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, EE.UU.). TBARS se expresan en términos de malondialdehído (MDA) niveles. En estos ensayos, un estándar de MDA se utiliza para construir una curva estándar contra el cual las muestras desconocidas se pueden trazar.

La carga de LysoTracker Roja

BMC se cultivaron en medio RPMI-1640. LysoTracker ™ rojo (Invitrogen / Molecular Probes) (100 nmol / l), un fluoróforo células permeante que típicamente se concentran en vacuolas ácidas, se añadió a BMC aisladas de control y los pacientes de FM. Después de 30 minutos, las células se lavaron, y la fluorescencia roja de LysoTracker se cuantificó con citometría de flujo.

PCR en tiempo real

La expresión de MAP-LC3 y beclin 1 genes en BMC fue analizado con SYBR Green PCR cuantitativa mediante el uso de extractos de ARNm y las cartillas. En tiempo real BECLIN 1 primers 5'-GGA TGG TGG AGA ATG AAG GCA AG-3 '(cebador) y 5'-TGA GGA CAC CCA AGC AAG ACC-3' (cebador inverso) amplificar una secuencia de 152 nucleótidos. Humanos MAP-LC3 primers 5'-GCC TTC TTC CTG CTG GTG AAC-3 '(primer avance) y 5'-CAG CGT CGT CCT CTT TCT CC-3' (cebador inverso) amplificar una secuencia de 91 nucleótidos. La actina se utilizó como un control del gen de limpieza.

Medición de la actividad citrato sintasa

La actividad específica de la sintasa de citrato en células enteras extractos preparados a partir de PMP se midió a 412 nm menos 360 nm (13,6 mmol / l / cm) mediante el uso de 5,5-ditio-bis (2-nitrobenzoico) para detectar grupos sulfhidrilo libres de la coenzima A, tal como se describe anteriormente [ 11 ].

La microscopía electrónica

BMC se fijaron durante 15 minutos con 2% de glutaraldehído en medio de cultivo y luego durante 30 minutos en 2% de glutaraldehído-0,1 mol / l NaCacodylate / HCl, pH 7,4. Las muestras se procesaron como se describe anteriormente [ 9 ]. Las observaciones se realizaron en un microscopio electrónico Philips CM-10 de transmisión.

El análisis estadístico

Todos los resultados se expresan como media ± desviación estándar, a menos que se indique lo contrario.El Student no pareada t test fue utilizado para evaluar la significación de las diferencias entre los grupos.El análisis estadístico incluyó Pearson correlaciones entre CoQ 10 niveles y autofágicas niveles de expresión génica. El P valores inferiores a 0,05 fueron considerados significativos.

 

Resultados

La disfunción mitocondrial en FM

La edad media de los pacientes fue de 50,8 ± 8,6 años para el grupo de FM y 49,1 ± 9,8 años para el grupo de control. La duración media de los síntomas en el grupo de FM fue 13,65 ± 9,19 años. Los puntos sensibles de medias en el grupo de FM fueron 14,9 ± 3,1 puntos. Las características más destacadas de estos pacientes con FM son dolor y rigidez. Eran las personas sedentarias. Las pruebas de rutina de laboratorio dieron resultados normales de glucosa, urea, ácido úrico, proteínas totales, creatinina, aspartato aminotransferasa, alanina (datos no mostrados) de transaminasas, colesterol y triglicéridos.

CoQ 10 niveles, determinados en el BMC aisladas de 20 pacientes con FM, se encontró que aproximadamente el 40% más bajos que en las células control (Figura (Figure1a).1a ). A fin de examinar la disfunción mitocondrial en los pacientes con FM de BMC, se determinó el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) con citometría de flujo. Potencial de membrana mitocondrial se redujo significativamente en un 36% en médula ósea de los pacientes con FM (Figura (Figura 1b1b ).


Figura 1

Coenzima Q 10 niveles y el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) en células mononucleares de la sangre (BMC) de la fibromialgia (FM) de los pacientes y sujetos sanos de control . (a) de CoQ 10 se midieron los niveles de alto rendimiento, la cromatografía líquida (más ...)

El estrés oxidativo en FM

El estrés oxidativo se ha propuesto como un evento relevante en la patogénesis de FM [ 3 , 12 ]. En un trabajo previo, que mostró la presencia de altos niveles de producción de ROS en los países miembros prestatarios de los pacientes con FM [ 5 ]. Para evaluar el origen mitocondrial de la producción de ROS, ósea de los pacientes con FM y los controles fueron expuestos a MitoSOX ™, un indicador rojo dismutasa mitocondrial. La cuantificación de la producción de ROS con el análisis de citometría de flujo demostró un aumento significativo en la producción de ROS en la mitocondria de la médula ósea de los pacientes con FM con respecto al control (Figura (Figure2a).2a ). Además, se determinó la peroxidación de lípidos como marcador de daño oxidativo inducido por el estrés de membrana mitocondrial por ROS en BMC y el plasma de pacientes con FM. En promedio, los pacientes con FM mostraron un mayor nivel de peroxidación lipídica, tanto en las células y el plasma, con respecto a los controles (Figura (Figure2b2b y and2c2c ).


Figura 2

Las especies reactivas del oxígeno (ROS) de producción y la peroxidación lipídica en la fibromialgia (FM) de los pacientes . (a) la producción de ROS se analizó en la médula ósea de los sujetos de control y los pacientes con FM con citometría de flujo, como se describe en Materiales y Métodos . La peroxidación lipídica (más ...)

Además de examinar el papel de la generación de ROS en la FM, BMC de un representante de los pacientes fueron incubadas con tres antioxidantes, CoQ 10 , α-toc, y N-Acet, y la producción mitocondrial de ROS fue examinado (Figura (Figura 3).3 ). Sólo antioxidantes lipofílicos, CoQ 10 y α-toc, la producción de ROS significativamente atenuada.


Figura 3

Efecto de los antioxidantes en las especies de oxígeno reactivo (ROS) de generación . Las células sanguíneas mononucleares (BMC) del representante de la fibromialgia (FM) de los pacientes fueron tratados con 10 mmol / L de CoQ 10 , 30 mmol / L α-tocoferol (α-toc), y 10 mmol / L (más ...)

La autofagia en la revista BMC de los pacientes de FM

Recientemente, se demostró que CoQ 10 deficientes en fibroblastos presentan mayores niveles de marcadores lisosomales (β-galactosidasa, la catepsina, LC3, y Tracker Liso) y una mayor expresión de genes autofágicas tanto a nivel transcripcional y translacional, indicando la presencia de autofagia [ 9 ].Para verificar que la CoQ 10 deficiencia también induce la activación de la autofagia en médula ósea de los pacientes con FM, lo primero que cuantifica los niveles de vacuolas ácidas en BMC mediante el uso de la fluorescencia y el análisis LysoTracker citometría de flujo. Vacuolas ácidas aumentaron significativamente en los países miembros prestatarios del paciente con respecto a los controles (Figura (Figure4a).4a ). Para dilucidar si la autofagia en la CoQ 10 con deficiencia de BMC pueden ser mitigados mediante la restauración de la funcionalidad mitocondrial de CoQ 10 suplementos, que cultivó tanto el control y el BMC de los pacientes en la presencia de CoQ 10 (100 mmol / L) durante 24 horas y se analizaron por fluorescencia LysoTracker . Como se muestra en la Figura Figure4b,4b , CoQ 10 suplementos reducido drásticamente la intensidad de la fluorescencia LysoTracker, lo que indica una reducción en la actividad lisosomal después de la CoQ 10 de tratamiento.


Figura 4

Autofágicas marcadores en las células mononucleares de la sangre (BMC) de la fibromialgia (FM) de los pacientes . (a)La cuantificación de las vacuolas ácidas en el control y BMC paciente por fluorescencia LysoTracker y el análisis de citometría de flujo. (b) Reducción de la fluorescencia LysoTracker (más ...)

Además, se analizó la expresión de genes implicados en los procesos de autofágicas, como BECLIN 1 yMAP - LC3 . Figura Figure5a5a y and5b5b muestran que los genes estaban sobreexpresados en autofágicas BMC de cinco de los ocho pacientes analizados en comparación con los controles. Los pacientes con FM con una mayor expresión de los genes autofágicas fueron aquellos con una más pronunciada la CoQ 10deficiencia (P3, P5, P6, P7, P8). Una correlación negativa se observó entre la expresión de genes autofágicas y CoQ 10 niveles ( r = -0.80, P <0,01 para BECLIN 1 , y r = -0.76, P <0,001 para MAP-LC3) (Figura (Figure5c5c ).


Figura 5

Genes de expresión de la autofagia . Los niveles de expresión deBECLIN un (a) y MAP-LC3 (b) las transcripciones en las células mononucleares de la sangre (BMC) del control y la fibromialgia (FM), los pacientes fueron evaluados con el tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como se describe en Materiales(más , ...)

Para determinar si la autofagia es específica para las mitocondrias, que examinó por primera vez la masa mitocondrial en BMC derivadas de pacientes con FM. Extractos de BMC se prepararon a partir de control y los pacientes de FM y se analizaron para la actividad citrato sintasa. Citrato sintasa es una proteína de la matriz mitocondrial, cuya actividad se ha demostrado que se correlaciona bien con la masa mitocondrial [ 13 ]. Figura Figure6a6a muestra una disminución estadísticamente significativa en la actividad de la citrato sintasa en la médula ósea de los pacientes con FM en comparación con los controles. La reducción en la actividad reproducible citrato sintasa indica una disminución de la masa mitocondrial y sugiere la degradación selectiva de las mitocondrias. Para confirmar la presencia de la degradación mitocondrial o mitophagy de BMC, que entonces realizó la microscopía electrónica de BMC de control y el paciente (Figura (Figure6b6b y and6c.6c . Figura Figure6c6c muestra claramente la presencia de los autofagosomas en la médula ósea de un representante de FM paciente (P6), lo que indica una amplia autofagia de las mitocondrias. En autofagosomas tempranos, se puede observar claramente que las mitocondrias están siendo degradados.


Figura 6

Mitophagy en la fibromialgia (FM) de los pacientes . (a)Reducción de la masa mitocondrial en las células mononucleares de la sangre (BMC) de los pacientes con FM. Actividad de la citrato sintasa específica en médula ósea de los pacientes de control y FM se llevó a cabo, como se describe en Materiales y Métodos (más ...)
 

Discusión

Las mitocondrias generan energía principalmente en la forma del gradiente electroquímico de protones, que alimenta la producción de ATP, el transporte de iones, y el metabolismo. Las mitocondrias son también la principal fuente de ROS. Ambos complejos I y III, junto con la CoQ 10 , los electrones al oxígeno de fuga [ 14 - 17 ]. La CoQ 10 deficiencia ha sido asociada con una variedad de trastornos humanos, algunas de ellas causada por un defecto particular de CoQ 10 genes de la biosíntesis o como una consecuencia secundaria de otras enfermedades [ 18 , los 19 ]. Hallazgos recientes demuestran que la CoQ 10 la deficiencia altera la función mitocondrial y la organización mitocondrial complejo respiratorio, dando lugar a un aumento de la generación de ROS, la activación de la MPT, y el aumento de la autofagia de las mitocondrias disfuncionales por mitophagy [ 8 , 9 ]. En el presente estudio, encontramos que la CoQ 10 con deficiencia de BMC en los pacientes con FM mostraron altos niveles de producción de ROS en las mitocondrias y el aumento de los niveles de peroxidación lipídica, tanto en las células y el plasma. En este sentido, los altos niveles de peroxidación de lípidos y proteínas carbonilos [20 , 21 ] y alteraciones en la homeostasis del ATP de plaquetas se han observado en los pacientes con FM [ 22 ]. El hecho de que la CoQ 10 y α-toc, dos antioxidantes lipofílicos, redujo significativamente la producción de ROS mitocondrial, también sugieren que ROS se producen en el medio ambiente lipofílico de las membranas mitocondriales y que la CoQ 10 la deficiencia puede estar implicada en el estrés oxidativo en FM.

Si el daño oxidativo juega un papel en FM a través de la activación de la MPT y mitophagy, entonces las estrategias terapéuticas que reducen ROS puede mejorar el proceso patológico. ¿Cuál es la relación entre el estrés oxidativo y síntomas de la FM? Recientes estudios han demostrado que el estrés oxidativo puede causar sensibilización periférica y central y alterar la nocicepción [ 23 ], resultando en la hiperalgesia mediada por mecanismos antioxidantes, tanto locales como la columna vertebral. Además, el estrés oxidativo se incrementa en pacientes con síndrome de fatiga crónica [ 24 , 25 ]. Superóxido juega un papel importante en el desarrollo de dolor a través de la sensibilización periférica directa, la liberación de diversas citocinas (por ejemplo, el TNF-α, IL-1β, e IL-6), la formación de peroxinitrito (ONOO - ), y la activación de PARP [ 23 ]. Además, los estudios sobre la depresión, un síntoma típico en pacientes con FM, han aclarado la posible relación entre la depresión y la peroxidación de los lípidos [ 26 ]. La peroxidación lipídica puede jugar un papel importante en la depresión, y el efecto de la reducción de la peroxidación de la serotonina diferentes inhibidores selectivos de la recaptación de la depresión mayor fue demostrado por Bilici y colaboradores [ 27 ].

Además, y apoyar el papel de la disfunción mitocondrial, BMC de los pacientes con FM mostró una disminución del 36% del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), posiblemente debido a un flujo de electrones y la reducción del bombeo de protones causado por la deficiencia de CoQ. Curiosamente, una correlación positiva entre el contenido de CoQ 10 en el BMC y el músculo esquelético [ 28 , 29 ] se demostró, por lo que la CoQ 10 deficiencia y la disfunción mitocondrial también puede estar presente en otras células y tejidos en los pacientes con FM. Además, los cambios en la morfología y el número de mitocondrias se ha demostrado en el músculo esquelético de los pacientes con FM [ 30 - 32 ], lo que sugiere el papel de la disfunción mitocondrial en este trastorno. Coq deficiencia, la disfunción mitocondrial y alteración celular bioenergética también podría explicar la baja capacidad muscular y aeróbica se observa en algunos grupos de pacientes con FM [ 33 , 34 ].

Se ha propuesto que los daños ROS pueden inducir MPT mediante la apertura de los poros de transición de permeabilidad de la membrana mitocondrial interna [ 35 - 37 ]. Esto, a su vez, conduce a un colapso simultáneo de potencial de membrana mitocondrial y la eliminación de las mitocondrias disfuncionales por mitophagy. Nuestros resultados apoyan esta hipótesis, mostrando la presencia de mitophagy en el BMC de los pacientes con FM. La autofagia es una vía regulada lisosomal implicada en la degradación y reciclaje de materiales citoplasmáticos [ 38 - 42 ]. Durante la autofagia, los materiales citoplasmáticos son secuestradas en las vesículas membranosas, doble, 'autofagosomas', que luego se fusionan con los lisosomas para formar los autolisosomas, en los que la degradación de las estructuras celulares se produce. Muchas tensiones celulares puede causar la inducción de la autofagia, como el estrés del retículo endoplasmático, disfunción mitocondrial, o el estrés oxidativo [ 42 - 44 ]. 'Mitophagy "fue acuñado para describir la eliminación selectiva de las mitocondrias por la autofagia durante el desarrollo y en condiciones patológicas [ 36 , los 45 ]. En nuestro trabajo, el análisis bioquímico de la citrato sintasa se indica una disminución de la masa mitocondrial, lo que sugiere la degradación mitocondrial selectiva por mitophagy en la médula ósea de pacientes con FM. Estos resultados fueron confirmados con el microscopio electrónico que muestra claramente autofagosomas en las mitocondrias se están degradando. La autofagia puede ser beneficioso para las células mediante la eliminación de las mitocondrias disfuncionales, pero la autofagia masiva puede promover daño celular [ 41 ] y puede contribuir a la fisiopatología de la FM.

 

Conclusiones

Nuestro estudio apoya la hipótesis de que la CoQ 10 la deficiencia, el estrés oxidativo, y mitophagy amplia puede contribuir a la bioenergética celular de desequilibrio, comprometer la funcionalidad celular. BMC Performance anormal pueden promover el estrés oxidativo y pueden contribuir a alterar la nocicepción en FM.

 

Abreviaturas

α-toc: α-tocoferol, BMC: células mononucleares de sangre; CoQ 10 : la coenzima Q 10 , FM: FM; MPT: transición de permeabilidad mitocondrial; ROS: especies reactivas del oxígeno; TBARS: sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico.

 

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

 

Autores de las contribuciones

MDC, MDM, AMNF, IMCL, y JGM llevaron a cabo los estudios bioquímicos. DC y LGI llevaron a cabo los estudios de microscopía electrónica. PB y FC participó en el diseño del estudio y se realizó el análisis estadístico. PB, PN, y JASA concibe el estudio, participaron en su diseño y coordinación, y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

 

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas FIS PI080500 y EC08/00076 FIS, Ministerio de Sanidad, España.Los autores dedican este manuscrito a los pacientes con FM y AFIBROSE (Asociación de Fibromialgia de Sevilla) por su ayuda incondicional.

 

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